단백질 제거방법

생명공학에서의 단백질 제거방법의 단계

생명 공학 연구의 중요한 구성 요소는 단백질 공학 기술을 사용하여 단백질을 설계하거나 수정하는 것입니다. 이러한 단백질 정제 기술은 특정 산업 분야에서 단백질 특성을 최적화합니다. 이러한 기술은 과학자들이 관심 있는 단백질을 분리하고 정제하여 형태와 기질 특이성을 연구할 수 있도록 합니다. 또한 다른 리간드와의 반응 및 특정 효소 활성도 연구가 필요합니다. 필요한 단백질 순도는 단백질의 최종 용도에 따라 다릅니다. 일부 응용 분야에서는 원유 추출물로 충분합니다. 식품 및 의약품과 같은 다른 용도에는 높은 수준의 순도가 필요합니다. 단백질 정제를 위한 여러 기술 이 필요한 순도 수준에 도달하기 위해 사용됩니다. 각 단백질 정제 단계는 일반적으로 어느 정도의 제품 손실을 초래합니다. 따라서 이상적인 단백질 정제 전략은 가장 적은 단계로 최고 수준의 정제에 도달하는 것입니다. 사용할 단계의 선택은 표적 단백질의 크기, 전하, 용해도 및 기타 특성에 따라 다릅니다. 다음 기술은 단일 세포질 단백질을 정제하는 데 가장 적합합니다. 세포질 단백질 복합체의 정제는 더 복잡하며 일반적으로 다른 방법을 적용해야 합니다. 세포 내 단백질 정제의 첫 번째 단계는 조 추출물의 준비입니다. 추출물에는 세포질의 모든 단백질과 일부 추가 거대 분자, 보조 인자 및 영양소의 복잡한 혼합물이 포함됩니다. 이 원유 추출물은 생명 공학 분야의 일부 응용 분야에 사용될 수 있습니다. 그러나 순도가 문제가 되는 경우 후속 정제 단계를 따라야 합니다. 조단백 추출물은 화학 물질, 효소 , 초음파 처리 또는 French Press를 사용하여 세포 용해에 의해 생성된 세포 파편을 제거하여 제조됩니다. 추출물에서 파편 제거 이물질은 원심 분리로 제거되고 고형 잔류 물 위의 액체가 회수됩니다. 세포 외 단백질의 조잡한 제제는 원심 분리로 세포를 간단히 제거하여 얻을 수 있습니다. 특정 생명 공학 응용 분야의 경우 높은 비활성을 유지하면서 변성 없이 고온을 견딜 수 있는 열 안정성 효소에 대한 수요가 있습니다. 내열성 단백질을 생성하는 유기체는 때때로 극한 체라고 합니다. 내열성 단백질을 쉽게 정제하는 방법은 혼합물의 다른 단백질을 가열 한 다음 용액을 냉각하여 변성시키는 것입니다. 따라서 열 안정성 효소가 필요한 경우 개질 또는 재용 해되도록 허용됩니다. 변성된 단백질은 원심 분리로 제거할 수 있습니다. 현대 생명 공학 프로토콜은 종종 표준 절차를 위한 기성 설루션을 제공하는 많은 상용 키트 또는 방법을 활용합니다. 단백질 정제는 종종 필터와 준비된 겔 여과 칼럼을 사용하여 수행됩니다. 투석 키트의 지침을 따르고 올바른 용량의 올바른 용액을 추가하고 새 테스트 튜브에 칼럼을 통과 한 용매를 수집하는 동안 지정된 시간 동안 기다립니다. 크로마토 그래피 방법은 벤치 탑 칼럼 또는 자동화된 HPLC 장비를 사용하여 적용할 수 있습니다. HPLC에 의한 분리는 역상, 이온 교환 또는 크기 배제 방법과 다이오드 어레이 또는 레이저 기술로 감지된 샘플을 통해 수행할 수 있습니다. 과거에는 조 추출물에서 단백질을 정제하는 일반적인 두 번째 단계는 삼투 강도가 높은 용액에 침전시키는 것이었습니다. 단백질 침전은 일반적으로 황산암모늄을 염으로 사용하여 수행됩니다. 조 추출물의 핵산은 스트렙토 마이신 설페이트 또는 프로타민 설페이트로 형성된 응집체를 침전시켜 제거할 수 있습니다. 소금 침전은 일반적으로 고순도 단백질로 이어지지는 않지만 혼합물에서 원하지 않는 단백질을 제거하고 샘플을 농축하는 데 도움이 될 수 있습니다. 용액의 염은 다공성 셀룰로오스 튜브, 여과 또는 겔 배제 크로마토 그래피를 통해 투석을 통해 제거됩니다. 다른 단백질은 다른 농도의 황산암모늄에서 침전됩니다. 일반적으로 고 분자량의 단백질은 낮은 농도의 황산암모늄에서 침전됩니다. 역상 크로마토 그래피는 상대적인 소수성에 따라 단백질을 분리합니다. 이 기술은 선택성이 매우 높지만 유기 용매를 사용해야 합니다. 일부 단백질은 용매에 의해 영구적으로 변성되며 RPC 중에 기능을 잃게 됩니다. 따라서 이 방법은 모든 응용 분야에 권장되지는 않습니다. 특히 표적 단백질이 활성을 유지하는 데 필요한 경우에는 더욱 그렇습니다. 이온 교환 크로마토 그래피는 전하를 기준으로 단백질을 분리하는 것을 말합니다. 칼럼은 음이온 교환 또는 양이온 교환을 위해 준비할 수 있습니다. 음이온 교환 칼럼은 음으로 하전 된 단백질을 끌어당기는 양전하를 가진 고정상을 포함합니다. 양이온 교환 칼럼은 양으로 하전 된 단백질을 끌어당기는 역, 음으로 하전 된 비드입니다. 표적 단백질의 용출은 칼럼의 pH를 변경하여 수행되며, 이는 각 단백질의 하전 된 작용기의 변화 또는 중화를 초래합니다. 크기 배제 크로마토 그래피는 더 큰 분자가 크로마토 그래피 칼럼의 가교 중합체를 통해 더 빠르게 이동하기 때문에 더 큰 단백질과 더 작은 단백질을 분리합니다. 큰 단백질은 폴리머의 구멍에 맞지 않는 반면 작은 단백질은 덜 직접적인 경로를 통해 크로마토 그래피 칼럼을 통과하는 데 더 오래 걸립니다. 용출액은 용출 시간에 따라 단백질을 분리하는 일련의 튜브에 수집됩니다. 겔 여과는 표적 단백질이 처음에 칼럼에 추가된 것보다 적은 용출 부피로 수집되기 때문에 단백질 샘플을 농축하는 데 유용한 도구입니다. 비용 효율성 때문에 대규모 단백질 생산 중에 유사한 여과 기술을 사용할 수 있습니다. 친 화성 크로마토 그래피는 "연마"또는 단백질 정제 공정 완료에 매우 유용한 기술입니다. 크로마토 그래피 칼럼의 비드는 표적 단백질에 특이 적으로 결합하는 리간드에 가교됩니다. 그런 다음 유리 리간드를 포함하는 용액으로 헹구어 칼럼에서 단백질을 제거합니다. 이 방법은 다른 기술에 비해 가장 순수한 결과와 가장 높은 특정 활동을 제공합니다. 폴리 아크릴 아미드 겔 전기영동에 사용되는 나트륨 도데 실 설페이트는 단백질에 결합하여 큰 순 음전하를 제공합니다. 모든 단백질의 전하가 상당히 동일하기 때문에 이 방법은 거의 전적으로 크기에 따라 분리됩니다. SDS-PAGE는 종종 일련의 각 단계 후 단백질의 순도를 테스트하는 데 사용됩니다. 원하지 않는 단백질이 혼합물에서 점차적으로 제거됨에 따라 원하는 단백질을 나타내는 밴드가 하나만 있을 때까지 SDS-PAGE 젤에 시각화된 밴드 수가 감소합니다. Immunoblotting은 친 화성 크로마토 그래피와 함께 적용되는 단백질 시각화 기술입니다. 특정 단백질에 대한 항체는 친 화성 크로마토 그래피 칼럼에서 리간드로 사용됩니다. 표적 단백질은 칼럼에 유지된 다음 염 용액 또는 기타 제제로 칼럼을 헹구어 제거합니다. 방사성 또는 염료 라벨에 연결된 항체는 나머지 혼합물과 분리되면 표적 단백질의 검출을 돕습니다.